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实验一 微生物学实验室常秒速七星彩用仪器和设

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 文章来源:未知编辑:admin时间:2018-02-10 16:00

  实验一 微生物学实验室常用仪器和设备 实验目的 主要了解微生物学实验室常用的仪器和设备。 一、 火焰灯 火焰灯是接种工具灭菌及试管等物品无菌化处理的必备器材。 酒精灯、 煤气灯是较理想的接种环灭菌器材, 火焰的大小可根据需要自行调节。 火焰柱可分为两层: 外焰和内焰。 外焰由于接触氧气丰富, 热度很高, 所以烧灼接种环或物品时应使用外焰。 近年来, 市场上有电热接种环灭菌器, 使用比较安全, 特别适于结核杆菌实验操作。 二、 接种工具 可以分为接种环和接种针两类。 接种环用来挑取标本、 菌液及划菌落涂平板等, 直径一般为2~4mm, 也可依需要...

  实验一 微生物学实验室常用仪器和设备 实验目的 主要了解微生物学实验室常用的仪器和设备。 一、 火焰灯 火焰灯是接种工具灭菌及试管等物品无菌化处理的必备器材。 酒精灯、 煤气灯是较理想的接种环灭菌器材, 火焰的大小可根据需要自行调节。 火焰柱可分为两层: 外焰和内焰。 外焰由于接触氧气丰富, 热度很高, 所以烧灼接种环或物品时应使用外焰。 近年来, 市场上有电热接种环灭菌器, 使用比较安全, 特别适于结核杆菌实验操作。 二、 接种工具 可以分为接种环和接种针两类。 接种环用来挑取标本、 菌液及划菌落涂平板等, 直径一般为2~4mm, 也可依需要自定。 接种针则用来挑取单个菌落, 穿刺高层琼脂等。 为了适应不同的需要, 接种器可以做成各种形式(见图 1-1) 图 1-1 细菌接种工具 (有环者为接种环或称白金耳, 无环者为接种针或称白金针) 三、 显微镜 显微镜用于观察某些病原微生物和人体寄生虫的形态(包括病毒包涵体形态) 。 一般的光学显微镜就可满足常规要求, 其目镜常用 5×、 8×、 10×, 物镜常有 10×、 40×和 100×(油镜) , 细菌和某些寄生虫虫卵等检验常用油镜, 应注意保护油镜头。 有条件的实验室还可装备暗视野显微镜、 倒置显微镜、 荧光显微镜、 甚至能观察病毒等形态的电子显微镜。 四、 温箱 温箱是进行细菌培养的基本设备, 可调控温度范围一般在 20℃~60℃, 其容积可根据实际要求进行选择, 温箱有隔水式和非隔水式两种类型。 培养一般的细菌时, 温箱的温度应定在 37℃。 温箱应由控温仪进行温度控制, 以避免由于温箱偶然升温使细菌死亡, 或发育受影响。 另外, 温箱也可依需要设定其它温度, 如 26℃、43℃等。 五、 CO2培养设备 用于分离和培养需要 CO2气体才能生长的病原微生物。 市售专用的 CO2培养箱但对于常规实验室来说成本太高, 一般用蜡烛罐亦可满足要求以真空干燥罐、 标本缸、 甚至厌氧培养罐作为蜡烛罐, 将接种的平板和试管放在罐内, 然后放入点燃的蜡烛, 再将罐盖盖好并用凡士林密闭, 待蜡烛耗尽罐内的氧气, 自行熄灭, 即达到了所需的 5~10%的 CO2浓度。 将蜡烛罐放入普通温箱孵育便可。 也可用化学试剂产气法, 如每升体积需枸椽酸(CeksO7, ) 9. 3g、 Na2HCO30. 37g, 两试剂混合置一小烧杯中然后置于罐内。向烧杯中加入 10mL 蒸馏水, 立即将罐封闭, 如此产生的 CO2环境也比较理想。 六、 高压灭菌设备 高压灭菌器是微生物学实验室必备的设备, 用于培养基及其它物品的灭菌。 高压灭菌器有立式、 卧式之分。 也有比较小型的手提式高压灭菌器, 适用于小型实验室, 由于热源不同, 又可分为蒸汽式和电热式, 不同的实验室可根据具体情况选用。 七、 冰箱 冰箱是微生物学实验室用于储存制备好的培养基、 菌种、 试剂等的必需设备。 冰箱的种类很多, 家用和医用的均可。 用于储存培养基, 可选用 O℃~4℃范围的冰箱; 放置抗原、 抗体等试剂最好选用-20℃, 菌种保存放于-70℃冰箱最好。 实验二 消毒与灭菌 实验目的 熟悉和掌握对各种消毒灭菌法的原理及应用。 一、 常用的热灭菌器 (一) 干热灭菌器(烤箱) 干烤箱是两层金属板制成的方形或长方形密闭箱, 外壁内层装有隔热的石棉板, 箱底置有电炉, 并附有温度计和自动温度调节器。 主要用于平皿、 吸管、 试管等玻璃瓷、 金属等器材的灭菌。 灭菌时, 打开通气口, 加热到 80℃或 100℃, 再关闭通气口, 待温度达到 160~170℃,维持 2h。 最高温度不得超过 180℃, 超过 180℃时棉塞和包装纸会被烤焦。 灭菌后, 待温度下降到 80℃以下时, 再开箱取物, 否则, 冷空气突然进入, 会使玻璃器材炸裂。 (二) 高压蒸汽灭菌器 高压蒸汽灭菌器是一个双层的耐高压的金属圆筒, 附有贮水、 排水、 加热、 排气 阀门、 安全阀门和压力计等装置。 因其结构简单、 移动方便, 由于一般实验室常用小型的手提式高压蒸汽灭菌器。 使用时密闭, 所产生的蒸汽不能外溢而压力增加, 则容器内温度亦相应增高。通常用 15 磅/ 寸 2(1. 05kg/cm2) , 温度即可达 121℃, 维持 15~30min, 就可杀死一切微生物(包括细菌芽胞) 。 凡是耐高温、 不怕潮湿的物品, 如手术器械、 敷料、 手术衣、 橡皮手套、 生理盐水、 基础培养基和废弃培养物等均可用此法灭菌。 二、 紫外线nm 的紫外线具有杀菌作用, 其中以 265~266nm 为最强, 因其与 DNA 吸收光谱相一致。 其杀菌机制是使病原微生物 DNA 相邻的胸腺嘧啶形成二聚体, 从而破坏 DNA 构型,干扰其正常复制, 导致其死亡或变异。 紫外线杀菌力虽强, 但穿透力弱, 所以仅用于实验室、病房、 手术室的空气或物体表面的消毒灭菌。 [材料] 1. 大肠杆菌及葡萄球菌的 12h 培养物 2. 普通琼脂平板 3. 紫外线消毒箱、 接种环等 [方法] 1. 接种环火焰灭菌, 分别取大肠杆菌、 葡萄球菌培养物均匀地接种于两个平板上。 2. 半启平板盖, 置紫外灯下适当位置, 接受照射 30min。 3. 盖上平板盖, 置 37℃, 培养 16-18h, 观察结果。 [结果] 平皿暴露于紫外灯下的琼脂表面无菌或仅有少量菌生长, 而由平皿盖遮着的琼脂表面则有细菌生长。 三、 常用消毒剂的消毒作用 化学消毒剂种类很多, 其杀菌机理可有以下几类: (1) 使菌体蛋白变性或沉淀, 例如酚类(高浓度) 、 醇类、 重金属盐类、 酸碱类、 醛类。(2) 妨碍代谢中某些环节, 例如氯化剂的氯化作用、 低浓度重金属盐类与-SH 基结合、 Co及 CN-拮抗作用; (3) 损害菌细胞, 例如酚类(低浓度) 、 表面活性剂(肥皂、 去污剂、 胆盐类) ; (4) 影响细菌代谢, 例如染料。 本实验仅检测碘酒、 75%酒精、 3-5%来苏儿等几种消毒剂的灭菌效果。 [材料] 2. 5%碘酒、 75%乙醇、 3%来苏儿、 普通琼脂平板等 [方法] 1. 用玻璃笔在琼脂平板底面划十字线. 掀开平板盖, 将手指末端掌侧面在琼脂 A1、 区表面轻轻压一下, 盖好, 作为对照。 3. 选用下述方法分别消毒其余各手指末端掌侧面。 (l) 用 75%酒精棉球擦拭 lmin, 待干, 在 A2 区轻轻压一下。 (2) 用 2. 5%碘酒消毒后, 再用 75%酒精棉球擦去碘酒, 待干在 A3 区轻轻压一下。 (3) 3%来苏儿消毒 5min, 待干在 A4 区轻轻压一下。 4. 将平皿置 37℃, 培养 18~24h, 观察结果。 [结果] 观察琼脂表面各区菌落, 判断消毒剂的效果及生长情况。 思 考 题 1. 对可疑有芽胞的污染物, 选择什么方法灭菌? 2. 下列各物应选择什么方法消毒灭菌? 体温计、 注射器、 牛奶、 平皿、 试管、 普通琼脂培养基。 实验四 细菌的培养法 实验目的 掌握细菌培养法 一、 分离培养法和菌落观察 细菌在自然界分布广、 种类多; 临床检验标本, 如粪便、 痰、 脓汁中也常混有多种细菌。 若欲从标本中查出某种病原菌时, 必须先进行细菌分离, 以获得纯培养物, 再做进一步鉴定。分离培养方法有多种, 但常用平板划线法。 有些菌必要时尚可用动物接种分离法, 如肺炎链球菌。 划线方式很多, 要求借划线而将混杂的细菌在琼脂表面分散开来, 使单个菌能固定在一点上生长繁殖形成菌落, 从而达到获得纯种的目的。 [材料] 1. 大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养物 2. 普通琼脂平板 [方法] 分离培养法: 三段划线白金耳灭菌取材划原始区灭菌过原始区划第一区(约平板的 1/2) 灭菌划第 2 区(与第一区重合 1-2 条线) 灭菌划第 3 区(与第 2 区重合 2-3 条) 灭菌, 放 37 度培养 18-24 小时, 取出放 4 摄氏度冰箱。 1. 右手持灭菌的接种环(冷却 3~5Sec) , 取一接种环混合菌液。 2. 平板培养基放置时一般是平皿底在上, 平皿盖在下放置。 在划线时, 左手抓握平板(平皿盖则自然留在实验台上) , 尽量使之直立, 并靠近酒精灯周围, 以免空气中杂菌落入。 3. 将接种环上菌液涂于平板面的原始区, 并且来回划线, 涂成一薄膜。 划线时使接种环面与平板表面成 30~40 度角, 且轻轻接触, 以腕力在平板表面滑移。 4. 接种环反复火焰灭菌, 待冷, 按图 4-1 于 I、 II、 III 区划线, 但在划每区之前, 接种环都要火焰灭菌一次。 5. 划线结束后, 将平板培养基放回平皿盖内, 灭菌接种环后放回接种环架上, 用玻璃笔在皿底作标记。 6. 放 37℃恒温箱培养 18~24h, 观察平板表面生长的菌落状态。 [结果] 单个细菌在平板培养基上繁殖成一个肉眼可见的细菌集团, 称为菌落(Colony) 。 由于细菌种类以及培养基的成分不同, 菌落特点也不尽相同, 这有助于鉴别细菌。 因此, 应当对菌落进行认真观察, 选出目的菌菌落进一步检查, 观察要点如下: 1. 大小: 以直径(mm) 表示。 lmm 左右为小菌落, 2~3mm 为中等菌落, 3mm 以上为大菌落。2. 形状: 圆形、 卵圆形及不规则形。 3. 边缘: 整齐或不整齐、 锯齿状、 毛发状等。 4. 表面: 光滑、 湿润、 皱纹、 干燥等。 5. 隆起度: 扁平、 凸起、 中心凹陷等。 6. 透明度: 透明、 不透明、 半透明。 7. 颜色: 无色、 白色、 黄色、 绿色等。 8. 溶血性: 产生溶血毒素的细菌, 可以使血平板培养基中的红细胞破坏溶解。 分为完全溶血、草绿色溶血及不溶血。 9. 气味: 有些气味对鉴别细菌有意义。 10. 粘稠度: 粘稠、 稀薄等。 二、 纯种细菌接种法 平板分离培养获得目的菌纯种后, 常需接种至各有关培养基, 以进一步测试菌的其它生物学特性。 根据培养基的物理性状, 纯种细菌培养法有斜面培养基接种法、 液体培养基接种法和穿刺接种法三类。 [材料] 1. 琼脂斜面培养基 2. 半固体培养基 3. 蛋白胨水或肉场培养基 4. 大肠杆菌培养物 [方法] 1. 斜面培养基接种法用于接菌培养, 37 度培养 18-24 小时, 细菌为均匀一致, 菌苔。 琼脂斜面、 尿素、 枸椽酸盐等凡具有斜面外形的固体培养基均采用本法接种细菌。 (1) 用火焰灭菌后冷却的接种环, 挑取欲检查的目的菌少许。 (2) 左手拇指、 食指、 中指及无名指握持培养基试管, 斜面向上, 勿成水平, 以免管底凝结水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。 (3) 以右手手掌、 小指与无名指拔取并挟持培养基管棉塞, 将管口迅速通过火焰灭菌 2~3次, 以杀死管口周围的细菌。 (4) 将沾有目的菌的接种环伸进待接种培养基底部, 触及管底凝结水, 自下而上划一直线,然后再蛇形样划线) 接种完毕, 重新火焰灭菌接种环后放回架上, 试管口也再迅速通过火焰 2~3 次, 塞上右手夹持的棉塞, 并放回原来位置。 (6) 用玻璃笔在试管上写好日期、 菌名和实验者姓名等, 置 37℃, 培养 18~24h 后, 观察结果。 2. 液体培养基接种法用于增菌培养或生化反应, 以后 我们接种甘露醇培养基, 属液体 液体培养基细菌生长方式有三种: 混浊生长: 如大肠埃希菌; 沉淀生长: 乙型链球菌; 菌膜生长: 枯草杆菌 凡肉汤、 蛋白胨水等液体培养基均可采用本法接种细菌。 (1) 同斜面培养基接种法握持菌种管、 待接种的肉汤管及棉塞。 (2) 右手持接种环灭菌并冷却后, 伸入菌种管挑取少量细菌, 再伸入肉汤管中, 在稍离于液面的管壁上, 轻轻研磨, 使细菌落入肉汤中。 (3) 接种完毕, 将管口迅速在火焰上灭菌, 塞好棉塞, 接种环重新灭菌后放架上。 (4) 在试管上注明菌名、 接种日期等。 (5) 置 37℃温箱培养 18~24h, 观察结果。 3. 穿刺接种法 凡培养基呈高层者, 如半固体培养基、 醋酸铅培养基等均用此法接种。 (1) 同斜面培养基接种法握持菌种管、 待接种高层培养基及棉塞。 (2) 右手持接种针, 灭菌冷却后, 以针挑取菌苔, 垂直刺入高层培养基中心, 但不及管底, 距管底约 1/3 停止, 然后循原路退回。 (3) 塞好棉塞, 在试管上注明日期、 姓名等。 (4) 置 37℃温箱培养 18~24h, 观察结果。 半固体培养培养基接种法 此培养基用于保存菌种和观察细菌动力, 材料为金葡菌和大肠埃希菌。 不仅穿刺线上生长,而且自接种部位向四周扩散生长, 表现培养基浑浊; 无鞭毛细菌仅在接种部位生长, 培养基不表现浑浊。 [结果] 1. 斜面培养基 斜面有均匀一致湿润的菌苔, 如有不同的菌落出现, 则表明菌种不纯。 2. 液体培养基 在液体培养基中不同的细菌生长状态是不一样的。 大肠杆菌呈均匀混浊生长、 乙型链球菌呈沉淀生长, 有的细菌(如枯草杆菌) 呈菌膜生长, 在液表面形成菌膜。 3. 半固体培养基 有鞭毛的细菌, 自原接种部位向四周扩散生长, 培养基呈现浑浊状态; 无鞭毛的细菌仅在接种部位生长, 培养基不出现浑浊。 图 4-1 分离培养接种法 图 4-2 固体培养基接种法 A. 斜面培养基 B. 高层斜面培养基 C. 半固体培养基 细菌培养法结果观察 1. 普通营养琼脂平板: 在 1, 2 区出现单个菌落。 因接种材料为白色葡萄球菌, 肉眼可见白色中等大小, 边缘整齐, 湿润光滑型菌落。 2. 斜面培养: 接种材料为白色葡萄球菌。 在斜面可见白色均匀一致的菌苔。 3. 液体培养: 接种材料为白色葡萄球菌, 可见液体培养基混浊。 4. 半固体培养基: 接种材料为白色葡萄球菌, 培养基细菌仅沿穿刺线生长。 接种材料为大肠埃希菌的培养基可见细菌沿穿刺线长, 又向四周扩散生长, 培养基变混浊, 因该菌有鞭毛。 思 考 题 1. 各种培养法的主要用途? 2. 什么是菌落, 在鉴别细菌上有何意义? 3. 什么是培养基? 如何进行分类? 配制培养基的原则是什么 实验六 显微镜油浸镜的使用 实验目的 熟练掌握显微镜油浸镜的使用和保护方法。 一、 油浸镜的原理 油浸镜使用的镜油折光率与玻片相近似, 能抵消空气引起的散光现象。 自标本玻片透过的光线, 因介质密度(从载玻片至空气, 再进入油镜) 不同, 有些光线因折射或全反射, 不能全部进入透镜, 致使物象显现不清。 若在油镜与载物玻片中间加入和玻璃折光率(n=1. 52) 相仿的香柏油(n=1. 5l5) , 则使通过的光线无有损失, 进入透镜的光通量增多, 视野的亮度也就增强了, 因此便获得清晰的物像。 二、 油浸镜的使用方法 1. 双手托持显微镜, 轻放于自己面前的实验台上, 镜座距实验台边缘约 5 厘米。 2. 上升集光器与载物台相平, 将反光镜对准光源(自然光线用平面镜、 人工光源用凹面镜) ,光圈完全打开以增大射入光线. 用低倍接物镜调整光线, 看染色标本时要求视野达到最亮的程度。 4. 在标本上滴一滴香柏油, 再将标本置于载物台上, 用弹簧夹固定。 5. 转动旋转盘, 调换油浸镜头, 眼睛从镜筒侧面注视油镜头, 再小心转动粗调节器, 使镜头缓慢下降, 或缓慢上升载物台, 使镜头浸入油中至几乎与玻片接触为止, 切勿相撞。 这样做的目的是防止镜头压碎玻片而损坏镜头。 6. 在完成上述操作之后, 再一面从接目镜观察, 一面慢慢转动粗调节器, 使油镜头远离玻片。当见到视野出现模糊物像时, 立即停止, 再用细调节器调到物像清晰为止。 7. 镜检完毕, 转动粗调节器使油浸镜头远离载物台, 用拭镜纸轻轻顺一个方向擦去油渍, 必要时用擦镜纸蘸少许二甲苯再拭, 但应立即用拭镜纸擦干。 8. 取下标本片、 下降集光器、 竖起反光镜、 转动旋转盘, 将接物镜摆成低倍镜向前, 高倍镜与油浸镜头各向两侧的位置。 擦掉载物台上的油渍, 下降镜筒, 双手托持显微镜, 放入显微镜箱中。 三、 显微镜的保护 1. 显微镜是贵重精密仪器, 使用时要精心爱护, 不得随意拆御和碰撞。 2. 取送显微镜时应轻拿轻放, 双手托持, 一手握镜臂, 一手托镜座, 防止因震动使镜头受损。3. 显微镜的调节器是精密的机件, 只能做有限的旋转, 当旋转感到有阻力则表明已达极限,绝不能再继续向此方向旋转, 必须立即向反方向旋转退回。 4. 显微镜放置于干燥、 无尘地方。 思 考 题 1. 使用油浸镜时, 怎样调节光线和调节器才能使视野清晰、 物像清楚? 2. 如何保护显微镜? 实验七 细菌的染色法 实验目的 掌握细菌的革兰染色法并了解其他染色方法。 细菌的染色是染料分子与细菌成分相结合的化学过程。 细菌蛋白质是兼性电解质, pH 在 2~5 之间。 在近于中性环境中, 细菌多带阴电荷, 易与带阳电荷的碱性染料结合而着色, 因此细菌染色, 多用带阳电荷的碱性苯胺染料, 如美兰、 碱性复红、 龙胆紫等。 常用的细菌染色法有下列几种。 一、 单染色法 二、 复染色法 复染色法是用两种以上的染料染色, 可将细菌染成不同的颜色。 除可观察细菌的形态外, 还能鉴别细菌, 所以也称鉴别染色法 革兰染色法: 是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。 不仅可以鉴别细菌而且可以辅助临床选择有效的治疗药物和了解细菌的致病性 常见的革兰阳性菌和革兰阴性菌 细菌种类 需氧性 革兰阳性菌 革兰阴性菌 球菌 需氧/兼性需氧 葡萄球菌、 链球菌、 肺炎链球菌淋病奈瑟菌 杆菌 需氧/兼性需氧 结核杆菌、 白喉杆菌 大肠杆菌、 变形杆菌厌氧 破伤风梭菌 材料: 1、 葡萄球菌和大肠杆菌 18~24h 培养后的混合菌液 2、 革兰染色液(结晶紫染液、 卢戈染液、 95%酒精、 稀释石炭酸复红) 3、 载玻片、 酒精灯、 接种环、 染色架、 滤纸等 4、 显微镜、 双层瓶(内装香柏油和二甲苯)、 擦镜纸等 方法: 将玻片做好标记, 以区分正反面 1、 涂片: 用灭菌接种环取菌涂于载玻片上, 薄厚均匀, 直径约 1cm。 如为固体培养基上的培养菌, 则应于洁净载玻片上滴 1 滴生理盐水, 再用接种环取菌少许混于其中并混匀, 涂成菲薄的菌膜。 注意取菌量不要太多, 菌膜不要太厚。 2、 干燥: 一般置涂片于室温中自然干燥, 还可将菌膜向上, 放于温箱中或于酒精灯火焰上方热空气中干燥 3、 固定: 一般用加热法, 菌膜向上, 手持载玻片一段, 迅速通过酒精灯火焰 3 次(以玻片不烫手为宜), 目的是使菌细胞质凝固, 以固定细菌的形态 4、 染色: a、 初染: 滴加结晶紫染液, 染 1min, 水洗 b、 媒染: 滴加卢戈碘液, 染 1min, 水洗 c、 脱色: 放入 95%酒精罐内, 轻轻摇动玻片, 直至不再溶下染料为止, 约 30s,水洗(脱色不足: 阴性菌易被误染成阳性菌; 脱色过度: 阳性菌易被误染成阴性菌) d、 复染: 滴加石炭酸稀释复红液, 染 30s, 水洗 5、 用滤纸吸去水分, 干燥后镜检 结果: 革兰阳性菌染成紫色, 阴性菌染成红色 决定革兰染色的主要因素有: 1、 G+菌等电点(pH2~3) 低于 G-菌(pH4~5)。 在同样条件下,G+菌带负电荷多, 与带正电荷的结晶紫染料结合牢固 2、 G+菌细胞壁肽聚层数多, 经乙醇脱水作用, 肽聚糖网络结构变得更致密, 染料复合物不易从细胞内漏出。 而 G-菌细胞壁脂类含量多, 易被乙醇溶解, 使细胞壁通透性增高, 结合的染料复合物容易漏出。 两种因素中以后者更重要 意义: 鉴别细菌: 革兰染色阳性为紫色, 革兰染色阴性为红色; 细菌的致病性: 革兰染色阴性菌内毒素, 革兰染色阳性外毒素; 辅助临床选择有效治疗药物 [附录] 染色液的配制 1、 石炭酸复红染色液 碱性复红 3~7g 65%乙醇 100ml 将碱性复红充分溶解于乙醇中, 制成碱性复红饱和液, 可长期保存。 应用液 碱性复红饱和液 10ml 5%石炭酸溶液 90ml 将二者充分混合, 即成石炭酸复红染色液。 2、 稀释石炭酸复红染色液 石炭酸复红染色液 10ml 蒸馏水 90ml 二者混合即可。 3、 结晶紫染色液 结晶紫 7~14g 95%乙醇 100ml 将结晶紫于乙醇中充分溶解, 即制成结晶紫饱和液, 可长期保存。 应用液 结晶紫饱和液 20ml 1%草酸铵溶液 80ml 以上两者混合, 用滤纸过滤后即制成结晶紫染色液。 4、 芦戈(Lugol) 碘液 碘化钾 2g 碘 1g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶于少许蒸馏水中, 再加入碘, 使其完全溶解后, 再补充蒸馏水至 300ml 即成。5、 脱色液: 95%乙醇 6、 5%盐酸酒精 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml 二者混合即成。 思 考 题 1. 染色前, 涂片固定的目的和注意事项是什么? 2. 何为革兰染色? 有何意义? 注意事项是什么? 3. 进行革兰染色时, 用老龄细菌染色会出现什么问题? 实验八 细菌的药物敏感性试验 实验目的 熟悉并掌握细菌药敏测定的基本方法。 进行细菌的药物敏感性试验主要有两个目的: 一是帮助临床医师准确有效的利用药物进行治疗; 二是进行流行病学调查, 了解某些致病菌的耐药变迁情况 药敏试验的方法主要有扩散法和稀释法两种。 目前临床常用纸片琼脂扩散法, 其原理是将含有一定量的抗菌药物纸片, 平贴在已经接种被测细菌的琼脂平板表面, 纸片中的抗菌药物溶解于培养基内, 并向四周呈球面扩散, 药物在琼脂中的浓度随离开纸片的距离增大而降低。同时, 经过培养, 琼脂上的细菌开始生长, 当琼脂内的药物浓度高于该药对被检细菌的最低抑菌浓度(MIC) 时, 该菌的生长就受到抑制, 在含药纸片的周围形成抑菌环。 抑菌环越大,说明待检菌对被检抗菌药物越敏感。 [材料] 金黄色萄萄球菌临床分离株 多种抗菌药物干燥纸片 MH 琼脂平板 [方法] 1. 以无菌棉拭蘸取己制好的标准浓度(1. 5 亿/ ml) 的菌液, 均匀地涂布于 MH 平板表面,在室温中干燥数分钟。 或用接种环取少许供试菌纯培养物, 在 MH 琼脂平板上反复划线, 使细菌均匀地涂布于整个平板表面。 2. 用无菌镊子将含药纸片平贴于平板的表面, 轻轻压实。 每个平板均匀地贴 4 种含药纸片,纸片间距离不小于 24mm。 3. 纸片贴后 15min, 将平板倒置于培养箱中, 37℃培养 16~18h。 [结果] 观察纸片周围有无抑菌环, 并测量抑菌环的直径(以 mm 为单位) 。 临床常用抗菌药物的抑菌环直径表示该药的抑菌效果。 抑菌环的解释标准参见表 8-1。 抑菌环的大小以敏感、 中度敏感、 中介度和耐药的形式报告结果, 其意义如下: 1. 敏感: 表示被测菌株引起的感染可用常用剂量的该抗菌药物治疗, 禁忌症除外。 2. 中度敏感: 表示被测菌株可以通过提高剂量或在药物生理性浓集的部位被抑制, 如 -内酰胺类药物。 3. 中介度: 这一范围作为“缓冲域” , 以防止由于微小的技术因素失控而导致结果的解释错误。 抑菌环处于中介度范围, 认为意义不明确, 如果没有其它可以替代药物则须做稀释试验。4. 耐药: 被测菌不能被达到组织内或血液中的该抗生素常用剂量所抑制。 *该表数据是以肠杆菌科、 葡萄球菌、 假单胞菌属及某些链球菌为材料测定的。 抗 菌 药 物 纸片含药量 抑 菌 环 直 径 耐药 中介度 中度敏感 敏感 丁胺卡那霉素 氨苄青霉素 (肠杆菌) 0(葡萄球菌) 先锋霉素 头孢噻肟 氯霉素 强力霉素 红霉素 庆大霉素 卡那霉素 苯唑青霉素 青霉素 链霉素 磺胺 四环素 妥布霉素 30 g 14 15~16 - 17 10 g 11 12~13 - 14 10 g 75 g 30 g 30 g 30 g 15 g 10 g 30 g 1 g 10 g 10 g 250 g 30 g 10 g 28 15 14 12 12 13 12 13 10 28 11 12 14 12 - - - - 29 23 23 18 16 18 15 18 13 29 15 17 19 15 16~22 15~22 - - - - - - - - - - - 13~17 13~15 14~15 13~14 14~17 11~12 - 12~14 3~16 15~18 13~14 万古霉素 30 g 9 10~11 - 12 表 8-1 抑菌环直径及其解释标准 思 考 题 1. 细菌的药物敏感性试验有何实际意义? 2. 进行细菌药敏试验时应注意什么? 实验十二 临床标本中化脓性球菌的分离鉴定 实验目的 掌握从临床标本中分离鉴定化脓性球菌的基本原则和方法。为化脓性感染疾病的临床诊断提供依据, 并为临床选用有效的抗菌药物提供参考。 一、 革兰阳性球菌 (一) 标本的采集和处理 1. 按无菌操作原则采集标本, 尽量避免杂菌的污染。 2. 标本可按感染部位及感染性状的不同, 分别取脓汁、 创口分泌物、 血液、 尿液、 渗出液、脑脊液等, 其中尿液、 渗出液、 脑脊液需离心沉淀后进行分离培养; 血液标本需先增菌培养再进行分离培养。 3. 应在抗菌药物使用之前采取标本, 否则影响检出结果。 4. 注意脓汁的性状、 色泽及有无恶臭气味, 以区别是否为厌氧菌感染所致的化脓, 如怀疑是厌氧菌感染, 取材应避免接触空气, 及时送检, 进行厌氧培养检查。 (二) 检验程序 (三) 方法 1. 革兰染色 取标本(以脓汁为例) 涂片进行革兰染色, 观察细菌的形态、 排列、 结构和染色性。 如细菌为革兰阳性, 呈葡萄状排列的球形细菌, 可初判为葡萄球菌; 呈链状排列可初判为链球菌;呈矛头状, 成双排列, 尖端向外并有荚膜, 可初判为肺炎链球菌。 (化脓球菌分离培养同时涂片革兰染色镜检而对肠道致病菌分离时, 没对粪便材料涂片革兰染色. 因化脓球菌种类不同, 其形态, 结构, 染色性各表现不同, 经过染色镜鉴后可初步判定材料所含化脓球菌; 种类, 所以做革兰染色有意义; 而肠道杆菌无论是致病菌还是非致病菌都是革兰阴性杆菌, 无鉴别意义, 所以我们在对材料分离是不做革兰染色. ) 2. 分离培养 将标本划线接种于血琼脂平板(因化脓球菌营养要求较高) 上, 37℃温箱培养 18~24h 后观察菌落特点、 溶血性和产生色素等生长情况。 如菌落为中等大小(1~2mm) 、 表面光滑、 边缘整齐、 不透明、 周围有明显的溶血环, 且产生金黄色色素或白色色素, 可初判为致病性葡萄球菌; 如菌落细小(0. 5~0. 75mm) , 灰白色、 表面光滑、 有光泽、 周围有清晰透明溶血环可初判为乙型溶血性链球菌; 如细小菌落周围产生草绿色溶血环, 可初判为甲型溶血性链球菌或肺炎链球菌。 3. 纯培养 挑选上述可疑致病菌菌落, 接种于斜面上或血清肉汤培养基中, 置 37℃温箱, 培养 18~24h,获得纯培养, 供进一步鉴定用。 同时取同一菌落的细菌, 进行涂片、 染色、 镜检, 进一步确定其形态、 排列、 结构和染色性等。 4. 定向鉴定 (l) 葡萄球菌 ①甘露醇发酵试验 用接种环取斜面纯培养的细菌, 接种于甘露醇糖发酵管中, 37℃培养 18~24h, 观察结果。 若为阳性, 则为致病性葡萄球菌。 ②血浆凝固酶试验(玻片法) 在玻片的两端各滴一滴生理盐水, 用接种环挑取纯培养的细菌与之均匀混合。 在一端加入兔血浆 1 滴混匀, 另一端加生理盐水混匀(对照) , 迅速摇动玻片, 观察结果。 若在加血浆侧迅速(2 分钟内) 出现凝集现象, 而盐水对照侧未出现凝集者则判为阳性。 致病性菌株多数能产生此酶, 故该试验是鉴定致病性葡萄球菌的重要指标。 但近年来发现凝固酶阴性菌株也是某些感染的重要病因。 (2) 乙型溶血性链球菌 一般根据形态染色、 菌落特征和溶血情况可作鉴定。 但若确定其族、 种时必须参考有关专著进行生化反应和血清学分型。 (3) 甲型溶血性链球菌和肺炎球菌区别可用下述几种试验 ①菊糖发酵试验 肺炎链球菌菊糖发酵试验阳性, 甲型溶血性链球菌菊糖发酵试验阴性。 ②胆汁溶菌试验(试管法) 取待检菌肉汤培养物 0. 8ml, 加 10%去氧胆酸钠溶液 0. 2ml。 另取同一培养物 0. 8ml, 加生理盐水 0. 2ml 作为对照。 两管摇匀后, 置 37℃水浴 15~30min, 观察结果。 如加胆盐的培养物由混浊变成清亮, 而对照管仍均匀混浊, 则表明细菌被溶解, 胆汁溶菌试验阳性。 肺炎链球菌可产生自溶酶, 在胆汁、 胆盐存在下, 自溶加速, 故为阳性, 而甲型溶血性链球菌不产生自溶酶, 故为阴性。 ③Optochin 敏感试验 将被检菌接种血琼脂平板上 (密集划线, 涂匀) , 把直径 6mm 的滤纸片放入 1: 4000 Opto chi 水溶液中, 完全浸湿后, 分别贴于涂有细菌的平板上, 置 37℃培养 18~24 h, 观察结果。 若平板上的滤纸片周围有直径大于 20mm 的抑菌环, 为 Optochin 试验阳性。 若直径小于10mm 为 Optochin 试验阴性。 肺炎链球菌对 Optochin 敏感应为阳性, 而甲型溶血性链球菌对 Optochin 不敏感为阴性。 ④动物试验 小鼠对肺炎链球菌高度敏感, 杂菌污染严重的标本, 可取 0. 5~1. 0ml 悬液注射小鼠腹腔, 一般 24h 内小鼠死亡。 剖检后取心血或腹腔液分离培养, 常可获得肺炎球菌纯培养。 甲型溶血性链球菌不使小鼠致死, 故亦可用小鼠毒力试验与肺炎球菌相区别。 此外, 亦可用荚膜肿胀试验确定肺炎链球菌的型别。 二、 革兰阴性球菌 化脓球菌的系统检查 1. 观察单个菌落是否在划线上生长, 否则为污染菌; 2. 选在划线上生长并具有以下特点的菌落为可疑菌; 中等大小, 表面湿润边缘整齐, 白色菌落且周围有透明溶血环; 3. 选一个可疑菌落, 用接种环取一般细菌接种斜面纯培养, 另一部分涂片染色, 注意取菌涂片前先取盐水放于玻片上, 再按上次革兰染色法操作。 1. 甘露醇发酵试验 用接种针从斜面取纯培养细菌, 接种到甘露醇糖管的液面以下, 在管壁研磨。 取出接种针灭菌。 将该甘露醇管做好标记放 37 摄氏度培养 18-24 小时。 2. 血浆凝固酶试验: 因致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶, 在兔血浆中细菌积聚成团, 肉眼可见细菌集聚颗粒为阳性。 兔血浆测出现凝集颗粒, 证明该菌为致病性葡萄球菌。 但值得注意的是, 近年来凝固酶阴性的葡萄球菌菌株也是某些感染的主要病因。 3. 药物敏感性试验(药敏试验) 细菌的药物敏感实验是指在体内测定抗菌药物抑制或杀死细菌的能力。 常用的方法为扩散法。 其意义是对临床选用有效敏感药物治疗感染性疾病具有重要意义。 方法: 1) 斜面取纯培养物, 在普通营养琼脂上先划十字线, 然后均匀涂布于整个平板的表面。 2) 无菌镊子将含有一定量的药片贴于平板表面, 药片间距不少于 24mm, 药物各称朝上。 3) 15 分钟后, 在平板底部记好班组、 姓名、 日期, 放 37 摄氏度培养 18-24 小时。 药片种类: 奥(澳格门丁) 、 菌必治、 西力欣、 先锋必素、 氨曲南、 氟嗪酸、 左氧氟沙星、 环丙沙星、呋喃妥因、 复方新诺明、 氟哌酸 化脓球菌的系统检查 1. 药敏结果观察: 观察纸片(药片) 周围有无抑菌环, 以毫米为单位, 测量抑菌环直径。 以临床常用抗菌药物的抑菌环直径与结果解释的标准为准, 报告结果。 2. 药敏结果报告: 以敏感, 中度敏感, 中介度, 耐药的形式报告 1) 敏感: 表示被测菌株引起的感染, 可用常用剂量的抗菌药物治愈。 2) 中度敏感: 表示被测菌株可以提高剂量或在药物生理性浓集的部位被抑制。 3) 中介度: 这一范围作为“缓冲域” 一方只有微笑的技术因素导致较大的结果解释错误, 抑菌环直径落入中介度范围, 认为意义不明确。 4) 耐药: 表示被测菌株不能被常用剂量所达到的组织内或血液中的抗生素所抑制。 总结: 通过对化脓球菌感染材料的系统检查, 我们可以从以下几点得出该致病菌为致病性有色葡萄球菌: 革兰阳性球菌, 成葡萄状排列; 血平板上生长中等大小菌落, 边缘整齐, 光滑, 有色素。 菌落周围有透明溶血环; 甘露醇发酵试验阳性; 血浆凝固酶试验阳性 思 考 题 1. 致病性葡萄球菌的特点有哪些? 鉴定致病性葡萄球菌常用的方法有哪些? 2. 脑膜炎奈瑟菌与甲型溶血性链球菌的鉴别方法有几种? 鉴别二者有何实际意义? 3. 从临床标本中分离培养脑膜炎奈瑟菌要注意什么问题? 实验十四 致病性肠道杆菌感染的实验室诊断 实验目的 掌握致病性肠道杆菌感染的微生物学诊断原则及方法。 肠道杆菌是一群生物学性状相似的革兰阴性杆菌, 其中对人有明显致病作用的主要是沙门菌属、 志贺菌属及埃希菌属中部分致病性大肠杆菌等, 分别引起肠热症、 痢疾、 胃肠炎、腹泻等疾病。 这些疾病的微生物学检查原则是: 致病性肠道杆菌的分离鉴定及血清学反应。本实验仅介绍粪便标本中致病性肠道杆菌分离鉴定方法和血清学诊断法。 一、 致病性肠道杆菌的分离和鉴定 (一) 标本的采集 1. 不同疾病取不同标本。 肠热症时病程第 1、 2W 取血或骨髓, 病程第 2W 后取粪便和尿;败血症取血液; 胃肠炎取便或呕吐物及可疑食物; 痢疾取粘液脓血便; 腹泻取粪便。 2. 粪便标本如不能及时进行检查, 应加 30%甘油缓冲盐水, 置 4℃保存。 (二) 分离鉴定程序。 (三) 分离培养 [材料] 病人粪便标本: SS 琼脂平板(因其为强选择性培养基, 在平板上肠道致病菌与非致病菌表现为菌落特点不同, 能加以鉴别。 ) 、 中国兰平板、 伊红美兰平板(EM 平板) 等 [方法] 1. 将粪便标本用划线培养法接种 SS 琼脂平板、 中国兰平板或 EM 平板上, 用记号笔于平皿底注明日期、 姓名等。 2. 置 37℃孵箱培养 18~24h, 取出观察菌落。 3. 鉴别培养基上, 各种肠道杆菌菌落特征如表 14-1 所示。 表 14-1 肠道杆菌在鉴别培养基上菌落的特征 培养基种类 非致病菌菌落 致病菌菌落 中国兰平板 SS 平板 EM 平板 中等大、 兰色、 不透明 中等大、 红色 中等大、紫黑色或紫红色 有金属光泽 较小、 淡红色、 半透明 较小、 无色或淡红色、 半透明 较小、 无色、 半透明 (四) 初步鉴定 [材料] 双糖铁培养基、 革兰染色液等 [方法] 1. 挑取可疑菌落进行革兰染色, 可见中等大小、 散在的革兰阴性杆菌。 2. 将可疑菌落接种于双糖铁培养基, 37℃培养 18~24h, 观察培养基变化。 可按表 14-2 进行初步判定。 表 14-2 可疑菌在双糖培养基上的结果解释 斜面(乳糖) 高层(葡萄糖) 动力 H2S 判断 + - - - + + + + + - + + - - +/- + 可能为大肠杆菌 可能为志贺菌属细菌 可能为伤寒沙门菌 可能为副伤寒杆菌或其他沙门菌 (五) 鉴定实验 用双糖铁培养基上的菌苔进行血清学鉴定和生化反应。 (一) 血清学鉴定 用已知抗体检测未知细菌, 是鉴定细菌特异、 敏感、 简便的方法。 根据分离菌初步判断的结果, 选择相应诊断血清进行玻片凝集鉴定。 沙门菌属细菌血清学鉴定方法如下。 [材料] 沙门菌因子诊断血清、 生理盐水及载玻片等 [方法] 一般取双糖培养基斜面培养物与沙门菌因子血清按属、 组及种的顺序做玻片凝集反应。 1. 将洁净载玻片划分数格, 用灭菌的接种环分别沾取 A E 多价混合血清及生理盐水滴于载玻片格内, 后者为对照。 2. 用灭菌接种环取待鉴定双糖培养基斜面上的细菌, 分别混于盐水和血清中, 轻轻摇动玻片,1~2 min 后用肉眼观察是否出现乳白色凝集块, 出现者为阳性, 否则为阴性。 3. 若生理盐水不出现凝集, 而 A~E 混合血清出现凝集, 该菌为 A~E 组内细菌。 然后以组特异 O 因子血清进行玻片凝集试验定组, 定组后同法再以 H 因子血清定种。 [结果] 1. 如待检菌与因子血清 A-E 多价血清、 O9 和 Hd 因子血清发生凝集, 参考表 14-3 即可确定该菌为伤寒杆菌。 表 14-3 常见沙门菌的抗原成分 组别 菌 种 O 抗原 H 抗原 第 1 组 第 2 组 A B C 甲型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 鼠伤寒沙门菌 丙型副伤寒沙门菌 1(2) . 12 1. (4) . 5. 12 1. (4) . 5. 12 (6) . 7. Vi a b i c - 1. 2 1. 2 1. 5 D E 猪霍乱沙门菌 伤寒沙门菌 肠炎沙门菌 鸭沙门菌 (6) . 7 (9) . 12. Vi 1. (9) . 12 3. 10 c d gm e. h 1. 5 - - 1. 6 2. 如不与 A E 混合因子血清发生凝集, 则该菌可能有 Vi 抗原, 应用 Vi 因子血清检查, 如仍不凝集则可能是不属于 A-E 组沙门菌, 可应用 A-E 组外的其他因子血清鉴定。 志贺菌属细菌和致病性大肠杆菌血清学鉴定都是用诊断血清做玻片凝集反应来进行鉴定, 鉴 定型别时,具体可参考诊断血清使用说明书进行。 (二) 生化反应 必要时需进行系列生化反应进行辅助鉴定, 常见肠道致病菌的生化特性见表 14-4。 表 14-4 常见肠道杆菌生化反应结果 菌 名 动力 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 硫化氢 蔗糖 鼠李糖 吲哚 甲基红 V P 枸橼酸盐 卫 茅 醇 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 甲型副伤寒沙门菌 乙型副寒沙门菌 鼠伤寒沙门菌 + + - + + +++ - + + - + + -/+ - + - + - - + - + + + - + + +++ - + - + - +/- + + + + / - - + - + + + + 丙型副伤寒沙门菌 猪霍乱沙门菌 + + - + + +/- - + - + - + + + - + + + - + - + - + + + + + /- + + 伤寒沙门菌 肠炎沙门菌 大肠杆菌 痢疾志贺菌 福氏志贺菌 鲍氏志贺菌 宋内志贺菌 + + - + + -/+ - + + - + + +++ - + - + - - + + + + + + + + - d (+) + + - - d (+) d - + - - - -/+ -/+ -/+ + - - -/(+) - - - + - +/- - +/- - +/- + - - -/+ - - - + - + - - - - + (+) + - (+) + - - + - - +/- + - - + - - -/+ - - - (+) + 注: +: 产酸; + : 产酸产气; d: 26~75%阳性; -: 阴性/不发酵。 二、 肠热症的血清学反应(肥达反应) 人体受伤寒沙门菌或副伤寒沙门菌感染后, 血清中可产生相应的特异性抗体, 故从病人血清中检出此类抗体有助于肠热症的诊断。 肥达反应(Widal reaction) 是用已知的伤寒沙门菌“O” 、 “H” (TO、 TH ) 和甲、 乙型副伤寒沙门菌(PA、 PB) H 抗原与患者血清进行定量凝集试验, 用以诊断肠热症。 [材料] 抗原: TO、 TH、 PA、 PB 菌液 患者血清(l: 10 稀释) 、 生理盐水、 凹窝板、 吸管等 [方法] l. 取一凹窝板, 每排孔分别标明“TO” 、 “TH” 、 “PA” 、 “PB” 字样。 2. 按表 14-5 加入生理盐水和病人血清, 依次进行血清倍量稀释。 3. 依次如下加入抗原: 在第一排各孔中分别加入“TO” 0. 25ml。 在第二排各孔中分别加入“TH” 0. 25ml。 在第三排各孔中分别加入“PA” 0. 25ml。 在第四排各孔中分别加入“PB” 0. 25ml。 表 14-5 Widal Reaction 操作示意表 单位: ml 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 生理盐水 患者血清(1: 10) 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 弃0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 去 血清稀释倍数 1: 20 1: 40 1: 80 1: 160 1: 320 1: 640 菌 液 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 0. 25 血清最后稀释倍数 1: 40 1: 80 1: 160 1: 320 1: 640 1: 1280 4. 摇动凹窝板, 使之充分混合。 37℃放置 2h, 再置室温过夜后观察结果。 [结果判定] 1. 小心取出凹窝板, 先不要摇动凹窝板。 2. 先看各排对照孔, 对照孔不出现凝集现象, 证明实验结果准确可靠。 3. 再从第一排第一孔看起, 按顺序进行观察, 并做记录。 4. 根据凝集程度强弱, 分别以++++、 +++、 ++、 +、 -等符号表示。 判定标准如下: (l) 盐水对照孔, 孔底沉淀物呈圆形, 边缘整齐, 在各孔观察结束后, 轻轻振摇可见 细菌分散变混浊。 (2) 试验孔自第一孔看起, 如有凝集, 可见孔底有沉淀凝集片, 边缘不整齐, 液体上 部澄清。 ++++: 凝集程度很强, 细菌全部(100%) 凝集成片, 液体澄清。 +++: 凝集程度强, 细菌大部分(75%) 凝集成片, 少部分沉淀于孔底, 液体轻度混浊。 ++: 中等强度凝集, 细菌部分(50%) 凝集, 部分菌体沉淀于孔底, 液体半澄清。 +: 凝集程度弱, 细菌仅少量(25%) 凝集, 大部分沉淀于孔底。 -: 无凝集, 菌体全部沉于孔底, 沉淀物呈园形, 与对照孔相似。 5. 血清凝集效价: 一般以出现++凝集的血清最高稀释倍数作为该血清凝集效价。 6. 结果分析 (1) 首先应考虑当地正常人抗体效价, 血清凝集价超过正常效价时才有诊断意义。 一 般情况下, TO 效价在 1: 80 以上, TH 效价在 1: 160 以上, PA、 PB 效价在 1: 80 以上才有诊断意义。 (2) 伤寒病人 O 抗体(IgM) 常较 H 抗体(IgG) 出现的早, 维持时间短, 大约可持续半年左右。 H 抗体出现较晚, 维持时间长达数年。 若 O、 H 凝集效价均高于正常值, 则伤寒菌感染的可能性较大。 若 O 凝集价高于 H 凝集价时, 则可能是感染早期。 (3) 若 H 凝集价高而 O 凝集价低于正常值, 有可能曾接受过预防接种或患过伤寒。 (4) 患过伤寒的人或接种过伤寒菌苗的人, 近期出现发烧症状时, 可产生非特异回忆 反应, 即 H 凝集价高, 但这种 H 高凝集价通常在 1W 内下降至正常。 (5) 由于采血时间不同, 肥达反应阳性率亦不同。 发病第一周为 50%, 第二周为 80%,第三周为 90%以上, 恢复期更高, 以后逐渐下降。 (6) 一次肥达反应结果难以确定时, 应在病程中进行复查, 若效价递增, 或恢复期效 价增高 4 倍或以上, 方有诊断意义。 (7)有少数病例在整个病程中, 肥达反应始终为阴性, 故阴性结果不能完全排除肠热 症,所以应当同时进行细菌的分离鉴定和密切结合临床其他指标共同分析。 肠道致病菌的系统检查 1. 观察平板上是否有单个菌落生长, 在划线上的单个菌落是否一致。 经观察为两种细菌菌落。 中等大小, 红色(SS 平板具有酚红指示剂) 菌落为非致病菌, 因其分解 SS 平板中的乳糖产酸使指示剂酚红变色, 较小, 无色或淡红色, 半透明的菌落为致病菌, 因其不分解乳糖。 2. 选致病菌菌落接种双糖铁培养基, 涂片革兰染色同上(示教) 。 3. 双糖铁培养基成分: 10%乳糖, 0. 1%葡萄糖, Fe4. 注意: 在该系统检查中, 我们把大肠埃希菌列位外致病菌。 但目前临床很多感染, 其病原为大肠埃希菌。 1. 双糖结果观察 1) 双糖培养基成分: 葡萄糖(0. 1%) 、 乳糖(1%) 、 硫酸亚铁、 硫代硫酸钠、 牛肉膏、 蛋白胨、 氯化钠、 酚红 结果: 1) 高层, 斜面全黄, 证明细菌分解葡萄糖, 乳糖产酸, 使指示剂酚红变黄, 该菌为非致病菌。 2) 高层变黄, 并有黑色沉淀, 斜面更红, 斜面更红因斜面部分由葡萄糖少量细菌分解葡萄糖产糖量少, 因接触空气而氧化, 又因细菌繁殖利用含氮物质生成碱性化合物, 使斜面变更红。 3) 高层变黄, 因细菌分解底层的葡萄糖产酸一时不...

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